神經系統**是世界范圍內的一個重大健康負擔，近六分之一的人患有神經系統**。

這些**會影響整個神經系統，包括大腦、脊髓和周圍神經系統 (PNS)，通常會導致殘疾或死亡。神經系統**可能由許多不同的因素引起，例如環境/營養影響、基因突變或外傷。示例是神經退行性**，如不同形式的癡呆（例如，阿爾茨海默氏癥）、帕金森氏病和肌萎縮側索硬化癥 (ALS)，還有中風、腦癌、傳染病（例如，腦膜炎）和損傷。

神經科學研究的重點是研究**神經系統 (CNS) 和周圍神經系統 (PNS) 的功能和組織，以了解神經過程并開發神經系統**和病癥的生物標志物和療法。

基于細胞的模型和檢測在分子和細胞神經生物學中起著重要作用，因為它們允許研究受控條件下的神經細胞類型及其對各種刺激的反應。體外試驗也可用于研究與**相關的神經功能變化的影響，以測試潛在的**方法。

在 ibidi 細胞培養室上生長的小鼠海馬神經元的共聚焦圖像。對神經元進行 bIII-微管蛋白（綠色）、肌動蛋白纖維（紅色）和細胞核（藍色）的**染色。圖片提供：意大利比薩高等師范學院 CNR 和 NEST 納米科學研究所的 Ilaria Tonazzini

在本篇文章中，我們將介紹 5 種基于細胞的體外試驗方法來研究神經系統狀況和**，并為每種檢測方法提供了應用示例。

01、熒光顯微鏡檢測

**熒光和熒光原位雜交 (FISH) 等熒光顯微鏡檢測用于使用熒光標簽或探針可視化細胞或組織內的特定分子或結構。

在細胞和分子神經生物學中，**熒光檢測（例如，**細胞化學、**組織化學和原位雜交）可用于獲得對大腦和神經網絡空間組織的重要見解。此外，標記蛋白質、DNA 和 RNA 可以可視化它們在這些網絡中的功能角色，并可以揭示過程是否中斷。**熒光是一種多功能、直接的方法，可以可視化細胞結構和成分的位置和相互作用。幾乎每個細胞生物學實驗室都可以輕松建立說明和工作流程。

多重熒光（同時對多種蛋白質進行染色）甚至可以同時顯示不同的分子，這對于破譯蛋白質的相互作用非常有用，例如，在神經信號過程中。

應用示例 1

**組織化學和熒光原位雜交 (FISH) 鑒定導致家族性 ALS 的突變

ALS 是一種慢性致命性神經退行性**，會導致運動神經元逐漸喪失。ALS 導致肌肉退化和虛弱加劇，*終導致喪失移動、說話、進食和呼吸的能力。

大多數 ALS 病例沒有已知原因（散發性 ALS），而 5% 到 10% 的病例是遺傳性的，可能與特定基因有關。在家族性 ALS 患者中發現了 FUS 基因的幾種突變。

Gadgil et al.使用熒光原位雜交 (FISH) 和**熒光來鑒定 ALS 相關的 FUS 突變 (FUS P525L)，該突變會破壞 U7 小核糖核蛋白 (U7 snRNP) 的定位。此外，他們還可以證明該突變體與 U7 snRNA 錯誤共定位到細胞質中并影響復制依賴性組蛋白基因（Gadgil 等人，2021 年）。

圖 1 SHSY5Y FUS 敲除細胞轉染含有 FUS 基因的質粒，FUS 基因帶有 ALS 相關的 FUS P525L 突變。轉染后 48 小時，對細胞進行 U7 snRNA 和 FUS 共染色。綠色：U7 snRNA 的 FISH 染色。紅色：FUS P525L。藍色：藍色的細胞核 (DAPI)。在ibidi蓋玻片底部培養室對細胞進行染色和成像。由波蘭波茲南 Uniwersytetu Poznańskiego 先進技術中心 RNA 加工實驗室的 Ankur Gadgil 友情提供。

02、活細胞成像

活細胞成像是一種強大的工具，可以實時可視化生理條件下的細胞過程。

阿爾茨海默氏癥或多發性硬化癥 (MS) 等神經退行性**的特征是大腦神經網絡內的動態細胞過程發生變化。這些改變的過程會導致大腦中蛋白質運輸和分類功能失調以及蛋白質聚集。神經遷移、趨化性和血管生成也是在神經健康和**中發揮重要作用的動態過程的示例（應用示例 2–5）。

活細胞成像允許在生理條件下實時跟蹤這些動態過程 ( 見下方視頻Mov. 1 )。

03、遷移和趨化性測定

細胞遷移和趨化性是神經系統的基本過程，在各種神經**的病理生理學中起著重要作用。例如，它們參與神經發育、受傷后的神經炎癥以及腦癌的進展過程。

通過在活細胞成像期間跟蹤單個細胞（應用示例 2）或通過將無細胞間隙引入細胞群并觀察細胞覆蓋區域的變化，可以在單細胞水平上研究細胞遷移動力學隨著時間的推移，間隙閉合（應用示例 3，工作流程圖 2）。

趨化性是細胞響應化學信號的定向運動。體外趨化性測定允許對細胞向特定分子的遷移進行定性和定量分析（應用示例 4，工作流程圖 3）。

應用示例 2

遷移原代雪旺細胞的活細胞成像

雪旺細胞是 PNS 的神經膠質細胞。它們支持和保護神經元，在傳遞神經沖動以及神經發育和再生方面發揮著重要作用。因此，他們對再生醫學非常感興趣，以開發在神經損傷情況下增強雪旺細胞遷移潛能的療法。Millesi et al.使用活細胞成像 (Mov. 1) 研究了初級雪旺細胞遷移。他們還探索了膠原蛋白纖維的再生作用，作為長距離周圍神經缺陷的**選擇（Millesi et al，2021 年）。

Mov. 1，雪旺細胞的活細胞成像，軌跡線跟隨其遷移模式。細胞在μ-Slide 4 Well上培養，并使用 ibidi Stage Top 孵育系統成像。使用 Image J Manual Tracking plugin和Chemotaxis and Migration Tool進行細胞追蹤和分析。友情提供：奧地利維也納醫科大學整形、重建和美容外科系的 F. Millesi。

應用實例 3

生長分化因子 11 (GDF11) 處理對軸突再生和細胞遷移的影響

創傷性脊髓損傷 (SCI) 可能是事故或**的結果。造成的傷害是不可逆轉的，通常會導致運動功能喪失和癱瘓。

**干預的重點是抑制脊髓急性損傷后的神經退行性過程。Tsai et al.研究了 GDF11 是否影響脊髓損傷后的神經生成。他們在存在和不存在 GDF11 的情況下對脊髓神經膠質細胞培養物進行了傷口**實驗（工作流程見圖 2）。2 天后，他們觀察到在 GDF11 存在的情況下細胞遷移和神經突延伸顯著增強（Tsai et al，2022 年）。

工作流程圖 2 使用Culture-Insert 2 Well進行傷口**實驗

應用示例 4

神經膠質瘤細胞對趨化因子 CC 配體 5 的趨化性測定

膠質母細胞瘤是一種生長迅速、侵襲性強的惡性腦腫瘤，預后較差（中位生存期為 1.5 年）。有多種**方法（手術、放療、化療），但由于殘留的膠質母細胞瘤干細胞具有耐藥性，腫瘤復發很常見。腫瘤微環境在其發展和進展中起著至關重要的作用。膠質瘤相關巨噬細胞 (GAM) 是浸潤在腫瘤微環境中的**細胞，與促進腫瘤生長、血管生成和侵襲有關。GAM 已被證明是 CC 基序趨化因子配體 5 (CCL5) 的來源，CCL5 是一種豐富的趨化因子，在細胞**反應中發揮促炎作用。它在 GAM 中的表達通過觸發細胞內鈣信號傳導和誘導基質金屬蛋白酶 (MMP) 進一步促進腫瘤進展。

Yu-Ju Wu et al.建立 3D 趨化性測定（工作流程圖 3）以研究存在和不存在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的情況下膠質瘤細胞的趨化性侵襲，GM-CSF 存在于體內膠質瘤微環境中( Yu -Ju Wu et al.，2020）。

工作流程圖 3 使用μ-Slide 細胞趨化載玻片進行趨化性實驗

04、管形成分析

血管發育（血管生成）是神經健康和**的關鍵過程。血管生成需要一系列由缺氧引發的細胞事件。

管形成試驗（工作流程圖 4）是一種廣泛建立的體外方法，用于研究血管生成和尋找促進或抑制血管生成的化合物。在神經退行性研究中，管形成分析可用于開發促進急性腦損傷后血管再生的療法（應用示例 5），或表征抑制為腦腫瘤提供營養的血管形成的分子。

應用示例 5

Tube Formation Assay 研究腦外傷后血管再生

創傷性腦損傷 (TBI) 可以通過多種方式影響腦血管，導致血腦屏障 (BBB) 破壞、顱內壓升高、腦血管痙攣和出血。這些影響會導致 TBI 后腦損傷和神經功能缺損的嚴重程度。FGF20是成纖維細胞生長因子家族的一員，已被證明具有神經保護作用，因此與帕金森病的**有關。

Guo et al.有興趣了解FGF20是否對 TBI 后的腦血管系統也有保護作用。因此，他們使用管形成試驗（工作流程圖 4）來研究 FGF20 是否可以在體外促進永生化人腦微血管內皮細胞 (hCMEC/D3) 中的血管生成（Guo et al，2021 年）。

工作流程圖 4 使用μ-Slide 15 Well 3D進行血管生成實驗

05、流動條件下的細胞培養

流動條件下的細胞培養是一種體外方法，用于模擬血管/**管的生理條件，并研究流體流動對內皮細胞產生的機械力（剪切應力）的影響。該技術已被用于包括神經科學在內的各個研究領域，以研究神經血管功能和神經病理學。

流動下的細胞培養使研究人員能夠在受控環境中研究機械力對內皮腦血管細胞和 BBB 的影響。通過使內皮細胞 (EC) 經受流體流動，研究人員可以模擬 BBB 的生理條件，并深入了解其功能和功能障礙的潛在機制（應用示例 6）。

應用示例 6

hCMEC/D3細胞流體環境下培養

與所有 EC 一樣，人腦微血管 EC 會受到血流產生的恒定機械力（剪切應力）的影響。與外周 EC 相比，剪切應力對 hCMEC 的細胞和分子效應知之甚少。

在*近的一項研究中，Choublier 等人。在生理層流下培養 hCMEC/D3 細胞以研究體外剪切應力的影響（工作流程圖 5）。

他們使用 hCMEC/D3 細胞作為體外模型來研究 BBB，因為它顯示了 BBB 的許多關鍵特性，包括緊密連接、轉運蛋白和酶。他們可以表明，與沿流動方向排列的外周內皮細胞相比，hCMEC/D3 細胞垂直于流動方向排列。隨后的蛋白質組學分析表明，層流生理剪切應力會誘導 hCMEC/D3 細胞靜止，從而導致 EC 以及 BBB 的保護和**作用（Choublier 等人，2022）。

工作流程圖 5 使用 ibidi通道載玻片和ibidi泵系統進行流體環境下的細胞培養。